生物化学实验教学大纲

实验一 基本操作训练和分光光度计的使用（4学时）

[实验目的]

              掌握一般玻璃仪器的洗涤方法和刻度吸量管的使用

掌握分光光度计的使用

了解实验室的一般规则，点收仪器

了解分光光度计的结构

[实验规则]

穿白大褂，保持安静、试剂使用方法、废液废物的处理、安排值日

[实验要求]  

预习、原始记录本、实验报告的格式格

[实验内容]

1.玻璃仪器的清洗：清点、洗涤

2. 刻度吸量管的使用：分类、使用方法、选用原则

3. 液体的混匀：旋转法、指弹法、甩动法、倒转法、搅拌法

   4．分光光度计的结构

   5．分光光度计的使用：标准对比法

[教学方法] 讲授法，启发式，自学辅导法，PBL/CBL、互动式教学、练习操作法

[教学手段] 多媒体教学、板书、模型

实验二 蛋白质的两性反应与等电点的测定（4学时）

[实验目的]

1.掌握蛋白质的两性电离和等电点、蛋白质变性。

2.了解蛋白质的两性解离性质。

3.了解测定蛋白质等电点的方法

[实验原理]

1.蛋白质是两性电解质。蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。

2.观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。

[基本操作]

    1．取洁净试管7支，按下表操作（单位：ml）

每管内加入酪蛋白1ml，混匀。

2．观察浑浊度并记录。

[注意事项]酸碱的滴加，随滴随摇

[教学方法] 讲授法，启发式，自学辅导法，PBL/CBL、互动式教学、练习操作法

[教学手段] 多媒体教学、板书、模型

实验三 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质（4学时）

[实验目的]

掌握不连续电泳分离物质的三个效应

[实验原理]

1.采用不连续系统（即缓冲液成分、pH值及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应，可将血清中各蛋白质成分按其分子大小、电荷多少而进行高效分离。

聚丙烯酰胺凝胶的结构和性质：

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳的不连续体系

3.浓缩效应、电荷效应、分子筛效应（与交联葡聚糖相比较）

 [基本操作]

准备电泳管、分离胶的制备与灌分离胶、浓缩胶的制备与灌浓缩胶、准备电泳槽、样品制备、上样、电泳、剥胶、固定、染色与漂洗

[注意事项]上样、剥胶

[教学方法] 讲授法，启发式，自学辅导法，PBL/CBL、互动式教学、练习操作法

[教学手段] 多媒体教学、板书、模型

实验四 血清谷丙转氨酶的活性测定（4学时）

[实验目的]

掌握测定血清谷丙转氨酶的原理

[实验原理]

血清中谷丙转氨酶（ALT）可催化丙氨酸与α-酮戊二酸转变成丙酮酸和谷氨酸。在一定条件下，血清中含谷丙转氨酶越多，则反应速度越快，生成的丙酮酸也越多。丙酮酸能与2,4–二硝基苯肼作用，生成黄色的丙酮酸–2,4–二硝基苯腙。在碱性条件下，上述产物呈棕红色，颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比。与经过同样处理的丙酮酸钠标准溶液进行比色，即可推算出血清中谷丙转氨酶的活性。

[基本操作]

按试剂量依次在各管加入试剂，将各试管内液体混匀后510nm波长处测定其吸光度值并记录数据，最后根据Beer定律计算：C样=A样/A标×C标（C标：100u/L）结果计算。

[注意事项]

本实验需取新鲜的血清做样品，因为血清中的酶在外环境中久置容易失活；在恒温水浴箱加热过程中，水浴箱的盖子不能盖上，防止水蒸气进入试管影响实验结果的准确性。

[教学方法] 讲授法，启发式，自学辅导法，PBL/CBL、互动式教学、练习操作法

[教学手段] 多媒体教学、板书、模型

实验五 酵母RNA的提取及成分鉴定（4学时）

[实验目的]

掌握浓盐法提取酵母RNA的原理及方法、熟悉核酸成分鉴定的方法

[实验原理]

利用浓盐及加热，使RNA以可溶性钠盐的形式析出，调节pH值至RNA等电点使其沉淀，有机溶剂去除杂质，提纯RNA。基本成分鉴定。磷酸与钼酸铵作用生成磷钼酸，再还原生成钼兰；核糖在浓酸作用下脱水，再与5-甲基间苯二酚反应生成鲜绿色物质；嘌呤与硝酸银在碱性下共热生成棕褐色嘌呤盐基银沉淀。

[基本操作]

选材酵母、浓盐法破壁抽取RNA、等电点法沉淀RNA、纯化RNA、溶解RNA、水解RNA、鉴定RNA水解成分

[注意事项]两次离心、两次使用氨水、两次调pH值、离心机的使用、冰浴

[教学方法] 讲授法，启发式，自学辅导法，PBL/CBL、互动式教学、练习操作法

[教学手段] 多媒体教学、板书、模型

实验六 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质（4学时）

 [实验目的]

掌握用醋酸纤维薄膜分离血清蛋白的原理和方法

了解电泳的基本原理及分类

[实验原理]

    1．电泳的概念：

    2．分类：

    3．基本原理：电荷效应   V=Eq/6πrη

    4．血清蛋白的分离：蛋白质是两性电解质，各种等电点不同，在缓冲溶液中依分子量大小与带电量不同区分。

[基本操作]

泡膜、仪器准备、点样、电泳、固定染色、漂洗、观察结果及定量

[注意事项]点样是本实验成功的关键，一定要强调及示范。

[教学方法] 讲授法，启发式，自学辅导法，PBL/CBL、互动式教学、练习操作法

[教学手段] 多媒体教学、板书、模型

实验七 福林-酚试剂法测血清蛋白含量（4学时）

 [实验目的]

掌握L-B定律在定量实验中的运用

掌握Folin-酚试剂法的显色原理

[实验原理]

    1．L-B定律

    数学表达式 A =εbc 、标准曲线的绘制、结果与计算、L—B定律的局限性

2．Folin-酚法的显色原理

    ①碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜复合物。

    ②复合物还原磷钼酸-磷钨酸，生成蓝色物质。蓝色强度与Pr含量成正比。

[基本操作]

    1．取洁净试管7支，按下表操作（单位：ml）

30分钟以后，以空白管为对照，在660nm处比色。

2．绘图及结果计算

[注意事项]吸量管的选用

[教学方法] 讲授法，启发式，自学辅导法，PBL/CBL、互动式教学、练习操作法

[教学手段] 多媒体教学、板书、模型

实验八 凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾（4学时）

[实验目的]

掌握分子筛效应分离物质的原理

掌握凝胶过滤分离物质的方法

了解层析技术分类及其分离物质的基本原理

[实验原理]

    凝胶的结构与性质：交联葡聚糖的交联度、G值与工作范围

    分子筛效应：

    透析的原理、鉴定：蛋白质用沉淀反应，磷酸用颜色反应

[基本操作]

凝胶准备、装柱、样品处理、上样、洗脱、收集、透析、鉴定

[注意事项]凝胶及透析袋的回收。

[教学方法] 讲授法，启发式，自学辅导法，PBL/CBL、互动式教学、练习操作法

[教学手段] 多媒体教学、板书、模型

实验九 酶法测血清葡萄糖和总胆固醇（4学时）

[实验目的]

掌握酶法测定血糖和总胆固醇的原理和方法

[实验原理]

葡萄糖与氧气在葡萄糖氧化酶的作用下生成葡萄糖酸与过氧化氢，过氧化氢与4-氨基安替比林和酚在过氧化物酶的催化下生成红色醌亚胺染料。在一定条件下，红色程度与葡萄糖含量成正比。在500nm波长下与标准同时比色测定求得血糖含量。本法测得正常值约为3.9-6.1mmol/L

胆固醇酯首先在胆固醇酯酶的催化下水解成游离胆固醇，胆固醇在胆固醇氧化酶的催化下生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的催化下以Trinder反应显色测定。

[基本操作]

    1．标本处理

    2．取3支洁净小试管，按下表操作

	空白管	标准管	待测管
血清（ul）	—	—	10
标准液（ul）	—	10	—
酶工作液（ml）	1.5	1.5	1.5

    混匀，置37℃水浴10分钟，在500nm波长下比色。

[结果计算]

    血糖/总胆固醇含量（mmol/L）=待测管吸光度/标准管吸光度×5.55/5.2mmol/L

[教学方法] 讲授法，启发式，自学辅导法，PBL/CBL、互动式教学、练习操作法

[教学手段] 多媒体教学、板书、模型

实验十 实验考查（4学时）

[实验目的]

检验学生通过一个学期的实验操作后对实验技术和基本原理的掌握程度。