课程名称

生物化学

授课题目（章节或主题）

凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾

授课教师

所属系（部）

基础医学院

所属教研室

生物化学与分子生物学

职称

授课时间

 年 月 日第 周 星期

授课时数

4学时

授课班级

              专业（本科□    专科□）        级      班

教学课型

理论课□   实验课 eq \o\ac(□,√)√   见习课□   习题课□   讨论课□   其它□

教材名称、作者、出版社及出版时间

生物化学与分子生物学实验教程 黄春霞、龙昱 人民卫生出版社 2017

教学目的要求：

1.掌握凝胶层析的原理及应用

    2.通过血红蛋白脱盐实验，初步掌握凝胶层析技术

重点与难点：

重点：凝胶层析技术的原理以及操作、透析技术的原理；

难点：凝胶层析技术操作中装柱、加样

教学方法（请打√选择）：

讲授法 eq \o\ac(□,√)√ 讨论法□ 启发式□ 自学辅导法□  练习法(习题或操作) eq \o\ac(□,√)√  读书指导法□      ＰＢＬ教学法 □  C B L教学法□ 其他□

教学手段（请打√选择）：

板书 eq \o\ac(□,√)√ 实物 eq \o\ac(□,√)√ 标本□  挂图□  模型□  投影□  幻灯 eq \o\ac(□,√)√ 录像□ CAI（计算机辅助教学） eq \o\ac(□,√)√

教学过程设计和教学内容：

引入：回顾理论课学习的内容，什么是电泳？

一、实验目的

1.掌握凝胶层析的原理及应用

2.通过血红蛋白脱盐实验，初步掌握凝胶层析技术

二、实验原理

本实验中，样品为血红蛋白与过量的高铁氰化钾（K₃Fe(CN)₆，Mw=327.25，黄色）反应生成高铁血红蛋白（MetHb，Mw=64500，红褐色）。为了除去多余的高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品，将上述混合物通过交联葡聚糖凝胶柱，用磷酸缓冲液洗脱，因凝胶颗粒带有小孔，在混合样品随洗脱液往下渗的过程中，K₃Fe(CN)₆因颗粒直径小于凝胶颗粒网孔直径，会进入凝胶颗粒组成的静止相中，在柱内停留的时间长因而流速慢以至最后流出柱外；而MetHb颗粒直径大，不能进入凝胶颗粒，只能留在凝胶颗粒之间的流动相中，路程较短因而先流出层析柱，因此可将MetHb完全分离出来。

    将凝胶过滤后收集的MetHb溶液装入透析袋。MetHb溶液中含有磷酸盐，经过透析使前者脱盐，而MetHb保留在透析袋内。用钼酸铵和氨基萘酚磺酸试剂进行磷的定性，用15%三氯醋酸的沉淀反应鉴定蛋白质。

三、实验仪器与试剂

层析柱、分液漏斗、铁架台、蝴蝶夹、止水夹、胶头滴管、透析袋（长10cm）、透析袋夹、磁力搅拌器

    0.4% K₃Fe(CN)₆、氨基萘酚磺酸试剂、钼酸铵试剂、15%三氯醋酸 、0.1M磷酸缓冲液（pH7.0）

四、实验操作

1．凝胶准备 

称取5g交联葡聚糖G-25，倾入锥形瓶中，加蒸馏水约60ml溶胀，搅动后静置。待凝胶沉积后，用倾注法除去浮于表面的细粒，重复3次。将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜。

2．排气泡

取层析柱一支，加入缓冲液，快速挤压下方的橡胶管，使柱底砂芯玻璃下方的气泡全部排出，充满溶液。排尽气泡后，放出多余的缓冲液至砂芯玻璃上方留有1～2cm溶液时，立即用止水夹关闭出口。

3．装柱

将排好气泡的层析柱垂直固定于蝴蝶夹上，然后将平衡好的交联葡聚糖G-25悬浮液边搅拌边加入柱内（用玻璃棒引流），再打开出口，使液体流出，凝胶颗粒缓慢沉积。继续不断地加入G-25悬浮液（每次补灌凝胶前应先用玻璃棒将已沉积的界面搅匀），至凝胶柱床沉积高度达到20cm左右时为止。凝胶沉积完成后，床面上应留下约2cm高的缓冲液，再关闭出口。

4．平衡

在分液漏斗中加入一定量的缓冲液，再将分液漏斗与层析柱相连，打开分液漏斗开关及层析柱出口，用磷酸缓冲液洗脱平衡约5～10min（注意流速不可过快，以免冲破胶面），最后关闭出口（胶面上方仍应保留约2cm高的缓冲液），加盖一层滤纸片。

5．样品的准备

取一支小试管，加入3滴血红蛋白液和8滴K₃Fe(CN)₆，混匀，制成MetHb的混合样品。

6．上样、洗脱

打开层析柱出口，使柱内溶液流出至刚露出胶面时即关闭出口。用胶头滴管吸取全部的混合样品，在距离胶面1mm处沿管内壁轻轻转动，缓慢加入样品，切勿冲破胶面。然后打开出口，使样品进入凝胶内，至胶面重新露出时立即关闭出口。用同样的方法再加入1-2倍样品量体积的缓冲液，打开出口让少量缓冲液流入胶面（此时样品应完全进入凝胶中）后立即关闭出口。再加入约3～4cm高的缓冲液（注意切勿扰动床面凝胶）后连接分液漏斗进行洗脱，流速约1滴/5s。

7．观察与收集

观察柱上的色带，待红褐色区带迁移至层析柱最下方时，将其收集至一小试管中。红褐色的MetHb色带收集完成后，继续用缓冲液将黄色的K₃Fe(CN)₆色带完全洗脱（不需用试管收集），然后关闭出口。

8．凝胶回收

回收凝胶时，将层析柱倒置，用洗耳球对准管口将凝胶吹出至原烧杯中，再用少量的缓冲液润洗管内残留的凝胶颗粒，同样回收至原烧杯内备用。

9．透析

扎紧透析袋的一端，并放入盛有蒸馏水的烧杯内浸湿备用。透析前，用滴管吸取收集在小试管中的MetHb洗脱液约30滴装入袋内（注意勿使洗脱液流到袋的外表面），排空袋内空气，用透析袋夹夹紧袋的另一端。然后将装好样品的透析袋放入盛有蒸馏水的大烧杯中，放置于磁力搅拌器上，调至适当的速度，透析30min。注意在放入透析袋前，先按下列两表中的要求分别取出适量的杯内蒸馏水，各自加入干净试管中留作对照。

10．鉴定

（1）磷酸盐的鉴定：按下表分别加入相应的试剂，混匀后观察和记录结果，并对实验现象作出解释。

（2）蛋白质的鉴定：分别加入相应的试剂，混匀后观察和记录结果，并对实验现象作出解释。

五、学生操作

学生操作时注意观察和提示。                                   

六、实验总结

1. 装柱后要检查柱床是否均匀。若有气泡或界面分层时，需用玻璃棒伸入层析柱搅匀，使凝胶重新沉积，必要时需重新装柱。

2. 上样时一定要靠近凝胶表面，沿柱内壁缓缓加入，不能冲破凝胶柱表面，保持胶面平整。

3. 控制流速，不能太快或太慢，并且在洗脱过程中要防止凝胶柱中的缓冲液流干。

4. 洗脱完成后凝胶要回收，勿丢弃，回收的凝胶必须用缓冲液浸泡，不能干燥。

5. 透析时透析袋内液体不可装满，且要排尽气泡，否则透析时会将透析袋胀破。

教学方法和注意事项

（包括重点、难点、教学方法、教学手段、更新教学内容、教书育人等）

应用讲述法简介层析技术

应用多媒体、录像、板书讲解

重点：层析技术和透析技术的原理

讲述法

配合多媒体、录像、板书简单讲述操作步骤

重点：装柱及其要求、加样、洗脱收集、透析

难点：装柱、加样

时间分配

1分

钟

5分钟

1分钟

8分钟

105分钟

10分钟

复习思考及作业题布置：

1.请解释凝胶过滤的分子筛作用是如何分离大小分子的？

2.在向凝胶柱中加入样品时，为什么必须保持胶面平整，上样体积为什么不能太大？

3.请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快或者太慢？

授课的创新点：

配备实验多媒体录像，直观表现。

参考资料（包括辅助教材、参考书、文献等）：

1.长沙医学院生物化学与分子生物学实验指导

2.生物化学与分子生物学第八版教材

教研室意见：

    教学重点突出，符合教学大纲要求。

教研室主任签章：             年　　月　　日

课后记（即通过收集教学督导专家、同行和学生的反馈信息，认真整理分析成功的经验和不足之处，在课程结束后填写）