课程名称

生物化学

授课题目（章节或主题）

醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质

授课教师

粟敏

所属系（部）

基础医学院

所属教研室

生物化学与分子生物学

职称

讲师

授课时间

年  月   日   第   周   星期

授课时数

4学时

授课班级

教学课型

理论课□    实验课√    见习课□     习题课□    讨论课□    其它□

教材名称、作者、出版社及出版时间

生物化学与分子生物学实验教程 黄春霞、龙昱 北京大学医学出版社 2014

教学目的要求：

1.掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的基本原理

2.掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的操作技术

3.了解醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的应用

重点与难点：

重点：醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的基本原理

难点：醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的操作技术

教学方法（请打√选择）：

讲授法√ 讨论法□ 启发式√自学辅导法□ 练习法(习题或操作) √读书指导法□ ＰＢＬ（以问题为中心的教学法）□ 其他□

教学手段（请打√选择）：

板书√ 实物√ 标本□ 挂图□ 模型□ 投影□ 幻灯√ 录像□ CAI（计算机辅助教学）√

教学过程设计和教学内容：

引入：醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质是属于分子生物学的范畴，普遍运用于分离蛋白质，其结果对临床相关疾病的诊断有积极的参考价值。

一、      实验目的

1.掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的基本原理

2.掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的操作技术

3.了解醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的应用

二、      实验原理

电泳是指带电粒子在电场中向与其电性相反的电极泳动的现象。带电粒子在电场中的泳动速度除与电场强度、溶液的性质等有关外，主要决定于分子颗粒所带的电荷数量及其分子的大小与形状等。带电荷量越多、分子量越小、形状越规则的蛋白质泳动较快，反之较慢。血清蛋白质约有两百多种，其等电点一般在pH 4.0-7.3之间，故在pH8.6的缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极移动。由于各蛋白质成份的pI不同，所带电荷数量不等，加之分子大小和形状的差别，导致其在同一电场中泳动的速度不同，从而可加以分离（见下表）。

表1  人血清蛋白质等电点及分子量

本实验是以醋酸纤维素薄膜作为支持物的一种电泳方法。醋酸纤维素薄膜具有均一的泡沫状结构（厚约120μm），渗透性强、对分子移动无阻力、分离清晰、无吸附作用、应用范围广和快速简便等优点，目前已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结构蛋白及同功酶的分离测定等。

醋酸纤维素薄膜电泳可把血清蛋白分离为清蛋白（A）、a₁-球蛋白、a₂-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。将薄膜置于染色液中使蛋白质固定并染色后，可以看到清晰的色带，而且由于各区带的颜色深浅与蛋白质含量几乎成正比，可将色带分别溶于碱溶液再进行比色测定，从而计算出血清蛋白的相对百分含量。

三、      实验仪器

电泳仪（稳压器、电泳槽）、分光光度计、醋酸纤维素薄膜（2cm×8cm）、点样器（用X光胶片制成）、表面皿、培养皿（供染色和洗脱用）、滤纸、镊子、5ml刻度吸量管、脱色摇床

四、实验试剂

1.新鲜血清：取全血5ml，离心取上清液。

2.巴比妥缓冲液（pH8.6）：巴比妥钠15.458g，巴比妥2.768g，溶于1000ml蒸馏水中。

3.氨基黑10B染色液：氨基黑10B 0.5g，加冰醋酸l0ml及甲醇50ml，混匀，用蒸馏水稀释至l00ml。

4.漂洗液（3%冰醋酸溶液）：95％乙醇45ml，冰醋酸5ml，混匀，用蒸馏水稀释至l00ml。

5.0.4mol/L NaOH：称取NaOH16g溶解蒸馏水中，定溶至1000ml，配制时结晶会发热，应边加水边混匀。

五、实验操作

1．薄膜准备 

醋酸纤维素薄膜呈白色，不透明，光面较毛面有光泽，干时脆，湿时有弹性。使用前，先将薄膜置于巴比妥缓冲液内，完全浸透至薄膜无白色斑点（约30min）备用。   

2．仪器准备

制作“滤纸桥”：剪裁尺寸合适的滤纸，取双层附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入缓冲液内。待缓冲液将滤纸全部润湿后驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即“滤纸桥”。它们的作用是联系醋酸纤维素薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。

 3．点样 

用镊子取出浸泡好的薄膜，夹在两片滤纸之间用手轻压，吸去薄膜表面多余的缓冲液。分清薄膜的光面和毛面，将毛面朝上，先用铅笔在薄膜的一端做好记号，然后在距离薄膜边缘约1.5cm处进行点样。点样时应注意点样器蘸取的样品量适当，不可过多，位置居中。点样采用“印章法”，双手将点样器垂直点在薄膜相应位置上，并停留2-3s，让样品完全渗入膜内。

4．膜条放置及平衡

点样完成后，将膜条转移至电泳槽的滤纸桥上。放置膜条时应注意，手不可触碰膜条，要将膜条的点样面朝下置于电泳槽的支架上，点样端放在负极端，并且点样处不可搭在滤纸桥上。放置好后还需要将膜条拉平整，排掉膜条与滤纸接触部位的气泡。然后平衡约5-10min，至缓冲液将薄膜全部湿润。

5．电泳 

检查电泳槽正负极连接是否准确，然后打开电源开关，调节电压至100-160V，电流为0.4-0.6mA/cm宽。夏季电泳时间约45min，冬季电泳时间约60min，待样品区带展开至薄膜三分之二处时，停止电泳。

6．染色 

用镊子小心取出薄膜，浸于氨基黑10B染色液中染色1-3min（注：薄膜需完全浸入染色液中且不重叠，染色时间以清蛋白染透为止）。

 7．漂洗 

准备3个培养皿，装入漂洗液。从染色液中取出薄膜放入培养皿中，在脱色摇床上漂洗数次，10min/次，直至背景无色为止。将漂洗干净的薄膜用滤纸吸干，此时可见界限清晰的五条区带，从正极端起依次为：清蛋白（A）、a₁-球蛋白、a₂-球蛋白、β-球蛋白及γ-球蛋白（见下图）。

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图1  正常人血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳示意图谱

8．定量分析 

取6支大试管并编号，分别用吸量管量取0.4mol/L NaOH 4ml放入试管内。剪下薄膜上的各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均大小的膜条作为空白对照，然后将六条带分别浸泡于试管内，不时摇动，使膜条上的颜色完全洗脱。30min后将洗脱液置于620nm波长处比色，分别读取各管的吸光度值并进行记录。

9．结果计算

根据所测定的吸光度值，分别计算五种蛋白质的相对百分含量及A/G比值，公式如下：

（1）各蛋白质的相对百分含量 = （x／T）×100％

其中x为该蛋白质的吸光度值；T为五种蛋白质的吸光度值之和

    （2）A/G比值（A为清蛋白的吸光度值；G为其余四种球蛋白的吸光度值之和）

正常参考值：

清蛋白：57.45-71.73%     a₁-球蛋白：1.76-4.48%     a₂-球蛋白：4.04-8.28%    

β-球蛋白：6.79-11.39%    γ-球蛋白：11.85-22.97%    A/G：1.24-2.36

  六、学生操作注意事项

1. 点样线要细窄、均匀、集中，量不宜过多，保持薄膜清洁。

2. 滤纸桥及醋酸纤维薄膜要放置平整，保证电场均匀。

3. 严格控制好电流、电压和电泳时间。电流过大会导致薄膜上水分蒸发过多，严重时使图谱短而不清晰；电流过低会使样品扩散，也不能得到良好的图谱。

七、临床意义

1. 肝硬化：清蛋白降低，γ-球蛋白极度升高；

2. 肝癌患者：清蛋白与球蛋白间多出一条甲胎蛋白（AFP）带；

3. 急慢性肾炎、肾病综合症：清蛋白降低，a₁、a₂和β-球蛋白升高；

4. 多发性骨髓瘤：清蛋白降低，γ-球蛋白升高，于β和γ-球蛋白区带之间出现“M”带。

八、实验小结

根据学生的实验过程和实验结果，有针对性的进行指导和分析。

此列为提示栏（包括重点、难点、教学方法、教学手段、更新教学内容、教书育人等）

重点

讲清楚电泳的概念，电泳分离蛋白质的原理，再讲分离血清蛋白质的原理，分步讲，逐步推进。

难点

点样的时候指导学生操作，按要求规范操作。膜条放的时候要注意学生看清正负极

染色和漂洗只需要少部分学生操作，其他学生要引导他们观察怎么操作。

剪下的膜条一定要准确。

时间分配

2分钟

13分钟

15分钟

60分钟

5分钟

15分钟

35分钟

10分钟

5分钟

复习思考及作业题布置

思考题：

1. 电泳时，点样端应置于电场的正极端还是负极端？为什么？

2. 引起电泳图谱不整齐、不清晰的原因有哪些？

3. 用醋酸纤维素薄膜作为电泳支持物有何优点。

授课的创新点：

本实验采用醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质，让学生动手掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的操作技术与应用

参考资料（包括辅助教材、参考书、文献等）：

长沙医学院自编《生物化学与分子生物学实验教程》

周爱儒主编《生物化学》

查锡良主编《生物化学》

教研室意见：

教学重点突出，符合教学大纲要求。

教研室主任签章：             年　　月　　日

课后记（即通过收集教学督导专家、同行和学生的反馈信息，认真整理分析成功的经验和不足之处，在课程结束后填写）

课堂效果好的教学方法：

多种教学方法教学手段的结合

需要改进的地方：

电泳时间较长，注意把握教学时间。