课程名称

生物化学

授课题目（章节或主题）

酶法测血清葡萄糖、胆固醇含量

授课教师

所属系（部）

基础医学院

所属教研室

生物化学教研室

职称

授课时间

授课时数

授课班级

             专业（本科□    专科□）        级      班

教学课型

理论课□    实验课þ    见习课□     习题课□    讨论课□   其它□

教材名称、作者、出版社及出版时间

生物化学与分子生物学实验教程 黄春霞、龙昱 人民卫生出版社 2017

教学目的要求：

1. 掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖、胆固醇含量的方法；

2. 熟悉酶法测定血液中葡萄糖、胆固醇浓度的原理；

3. 掌握测定血糖、胆固醇的临床意义。

重点与难点：

重点：酶法测定血液中葡萄糖糖、胆固醇浓度的原理；

难点：使用标准管对比法计算葡萄糖、胆固醇浓度。

教学方法（请打√选择）：

讲授法 þ  讨论法 □  启发式 □  自学辅导法 □  练习法(习题或操作) þ            读书指导法 □      ＰＢＬ教学法 □     C B L教学法 □    其他 □

教学手段（请打√选择）：

板书 þ   实物 □   标本 □   挂图 □   模型 □   投影 þ    幻灯 □         录像□     CAI（计算机辅助教学）□

教学过程设计和教学内容：

引入：血清葡萄糖测定的方法有邻甲苯胺法、氧化还原法以及葡萄糖氧化酶法，目前多采用氧化酶法，我们今天学习的测血糖的方法即为氧化酶法。提问：血糖的定义？

一、实验目的

1．掌握酶法测定血清葡萄糖、胆固醇含量的原理

2．熟悉酶法测定血清葡萄糖、胆固醇含量的操作方法

3．了解血糖、胆固醇变化的临床意义

二、实验原理

1.本实验利用两种酶（GOD：葡萄糖氧化酶；POD：过氧化物酶）偶联酶反应定量测定血清葡萄糖含量。具体反应如下：

醌亚胺染料在500nm处有特征性吸收峰，其颜色的深浅与葡萄糖的浓度成正比。

2.胆固醇测定同样采用多种酶偶联，具体反应如下：

过氧化物酶，4-氨基安替比林与酚合称PAP，生成的红色的醌亚胺色素在510nm处有吸收峰，吸光值与样品中总胆固醇的浓度成正比。

实验时采用已知浓度的葡萄糖、胆固醇溶液作标准管，经反应测定其A值（A_标），待测样品在同样条件下反应后测定其A值（A_待）。通过计算可得样品中葡萄糖、胆固醇的浓度。

三、器材与试剂

1．器材

学生实验仪器一套、分光光度计、比色皿、恒温水浴箱、低速离心机、离心管

2．材料及试剂

2.1葡萄糖测定试剂盒

（1）酶试剂：葡萄糖氧化酶>1 200U，过氧化物酶>1 200U（U是酶的活性单位），4–氨基安替比林0.8mmol/L。

（2）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）：Na₂HPO₄·7H₂O 22.5g，KH₂PO₄ 2.16g溶于蒸馏水中，定容至1 000ml。

（3）葡萄糖标准液：5.55mmol/L(100mg/dl)。

2.2总胆固醇测定试剂盒：胆固醇标准液浓度：5.2 mmol/L

2.3实验样品：新鲜无溶血血清

四、实验操作

1.标本处理：

   抽取全血37℃保温10分钟，3000转/min离心10min，取上清液备用。

2.取6支小试管编号，按表加入试剂：   

按表1、2所示在各管添加相应试剂。

表1 酶法测血糖实验各管试剂添加量

各管加好后混匀，置37℃水浴保温20min，用0.5cm光径比色皿在500nm波长下比色。

表2 酶法测血清胆固醇实验各管试剂添加量

各管加好后混匀，用0.5cm光径比色皿在510nm波长下比色。

注意：（1）3支试管为一组对照，所加入试剂量及一切反应条件（反应温度、湿度及时间）应保持一致。

（2）酶工作液的体积视当时的反应条件而定，此为建议值。反应后的红色溶液吸光度值适当（A值在0.2到0.5之间）即可。

（3）10μl液体不易精确加入，实验时要仔细检查微量移液器的密封性。此外，微量移液器Tip头外壁沾有的少许残留液体应在提出试剂瓶前在瓶口刮掉。

4． 记录A值，并进行计算。

【注意事项】

1．标准液吸取后应立即盖上，以防水分挥发。

2．液体浑浊或有絮状物视为失效。

3．本法特异性高，维生素C、谷胱甘肽、左旋多巴等引起负偏差。

五、学生操作并记录结果

六、实验结果计算

  根据Beer定律计算：

因：A_待/ A_标= C_待/ C_标(因每一管中加入的其他试剂体积一致)

故：C_待= C_标·A_待/ A_标

C_待：血清中葡萄糖或胆固醇浓度；            C_标：标准液中葡萄糖或胆固醇浓度

A_待：葡萄糖或胆固醇待测管吸光度值；        A_标：葡萄糖或胆固醇标准管吸光度值

代入已知数据即得结果。

七、总结

1.人空腹血糖的正常值为3.89—6.11mmol/L，根据学生实际果分析出现误差的原因，如：操作不规范，使用微量移液器及分光光度计不规范、计算错误等。

2.结合理论知识，分析血糖为什么能维持恒定？

3.分析激素对血糖的影响。

4.本法优点：特异性高；缺点：干扰因素多，维生素C、谷胱甘肽、左旋多巴等引起负偏差。

5.血清总胆固醇危险阈值：5.2-6.2mmol/L；高胆固醇血症：＞6.2mmol/L

6.TC增高：常见于动脉粥样硬化、高脂蛋白血症、梗阻性黄疸、肾病综合征、甲状腺功能低下、慢性肾功能衰竭、糖尿病等

7.TC降低：常见于低脂蛋白血症、贫血、肝脏疾病、营养吸收不良、恶性肿瘤等。

教学方法和注意事项

问题式导入，师生互动

简单介绍葡萄糖试剂盒的配置和储存要求

注意：1. 加入液体是先加少体积的溶液，再加体积多的溶液；

2. 实验中要检查移液枪的密封性，枪头外壁沾有的残留液体要用滤纸小心吸干；

3. 10μl液体必须全部溶于1.5 ml酶工作液中。

复习标准对比法的相关内容

提问：血糖的来源和去路

时间分配

2分钟

6分钟

2分钟

15分钟

5分钟

10分钟

复习思考及作业题布置：

1.正常人的血糖为什么能维持在一定水平?

2.胰岛素和肾上腺素对血糖有何影响?为什么?

3.本试验测定血糖的基本原理是什么?在那些情况下需做血糖含量的测定?

授课的创新点：

本实验通过采用试剂盒检测血清中葡萄糖、胆固醇含量，从血清制备到分光光度计使用，让学生全面掌握血清中代谢物的含量测定。

参考资料（包括辅助教材、参考书、文献等）：

1.查锡良、药立波主编，生物化学与分子生物学，第八版；

2.周爱儒主编，生物化学

教研室意见：

教学重点突出，符合教学大纲要求。

教研室主任签章：             年　　月　　日

课后记