《生物化学与分子生物学》实验指导书
来源:    发布时间: 2021-11-19 18:23   262 次浏览   大小:  16px  14px  12px

《生物化学与分子生物学》实验指导书

(供医学检验技术专业用)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

   医学检验实验中心

   

 

 


 

 

实验一:实验室基本技能操作训练……………………………………1

实验二:硫酸铜溶液标准曲线的绘制…………………………………5

实验三:双缩脲法测定血清总蛋白……………………………………7

实验四:紫外分光光度法测定血清白蛋白……………………………11

实验五:溴甲酚绿法测定血清白蛋白…………………………………13

实验六:醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质…………………………17

实验七:聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质………………………21

实验八:SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质………………29

实验九:凝胶过滤法分离高铁血红蛋白和高铁氰化钾………………33

实验十:琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶…………………39

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


实验一   实验室基本技能操作训练

一、实验目的

1.掌握一般玻璃仪器的洗涤方法;

2.掌握一般玻璃仪器及移液器的正确使用。

3.熟悉生化常用实验样品的制备及操作方法。

4.了解临床生物化学实验室的基本要求。

 

二、一般玻璃仪器的洗涤

1可以用毛刷刷洗的:

试管、烧杯、量筒等。洗涤过程:先直接用自来水冲洗,然后用肥皂水刷洗,接下来用自来水冲洗多次,把肥皂水去除干净,最后用蒸馏水润洗2-3遍,倒置沥干备用。洗净的容器水壁应是光洁不沾挂水珠。

2不能用毛刷刷洗的容量分析仪器的洗涤:

滴定管、移液管、刻度吸量管和容量瓶等。洗涤过程:首先自来水冲洗多次,待沥干后,再用铬酸洗液浸泡24-48小时,然后再用自来水冲洗干净,最后用少量的蒸馏水润洗2-3遍,沥干备用。

3新购容器的洗涤:

因新购买的容器表面附有游离的碱性物质和淤泥,先用肥皂水洗涮,再用自来水洗净,然后泡于2%的稀盐酸溶液中,不少于4h,再进一步的用自来水冲洗干净,蒸馏水润洗2-3遍,沥干备用。

4装有传染样品的容器的洗涤:

先用巴氏消毒液消毒,然后肥皂水冲洗    自来水冲洗,最后沥干备用。

5比色杯的洗涤:

使用鸡毛或毛笔洗。

 

三、常用玻璃仪器及移液枪的使用

1吸量管

吸量管种类奥氏吸量管、移液管或移液吸量管、刻度吸量管。

规格:0.1mL0.2mL0.5mL1mL2mL5mL10mL

使用:吸量管刻度分到尖端和不到尖端两种、所标刻度有自上而下或自下而上的两种:刻度到尖端且小于或等于2ml的吸量管,在取液时要吹出残留在尖端的液体。

(1)执管:将中指和拇指拿住吸量管上口以食指控制流速;刻度数字应朝向操作者。

(2)取液:把吸量管插入液体内(切忌悬空,以免液体吸入洗耳球内),用洗耳球吸取液体至所取液量的刻度上端12cm处,然后迅速用食指按紧吸量管上口,使管内液体不再流出。

(3)调准刻度:将已吸足液体的吸量管提出液面,然后垂直提起吸量管于供器内口(管尖悬离供器内液面)。用食指控制液流至所需刻度,此时液体凹面、视线和刻度应在同一水平面上,并立即按紧吸量管上口。

(4)放液:放松食指,让液体自然流入受器内,(如移液管标有“吹”字,则应将管口残余液滴吹入受器内)此时,管尖应接触受器内壁,但不应插入受器内的原有液体之中,以免污染吸量管及试剂。   

(5)洗涤:吸取血液、尿、组织样品及粘稠试剂的吸量管,用后应及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗,待实验完毕后,用自来水冲洗干净。晾干水分,再浸泡于铬酸洗液中,数小时后,再用流水冲净,最后用蒸馏水冲洗。晾干备用。

吸量管的选用原则:

(1) 量取整数量液体时,应尽量选用奥氏吸量管;

(2) 量取液体体积较大时可用移液管;

(3) 选用与取液量最近的吸量管;

(4) 在同一实验中,若几支试管中需加入不同量的同一种液体时、要根据加入液体的体积酌情选用。

2移液器

常用规格:10μL20 μ L100 μ L200 μ L1000 μ L5000 μ L

移液器的使用方法:

    1设定容量值:转动加样器的调节旋钮,反时针方向转动旋钮,可提高设定移液量。顺时针方向转动旋钮,可降低设定移液量。在调整设定移液量的旋钮时,不要用力过猛,并应注意使移液器显示的数值不超过其可调范围。

    2预洗:当装上一个新吸头时应预洗吸头,先吸入一次液体并将之排回原容器中。

    3吸液:

1)选择合适的吸头安放在移液套筒上,稍加扭转压紧吸嘴使之与套筒之间无空气间隙。(2)取液之前,所取液体应在室温(15℃-25℃)平衡。(3)把按钮压至第一停点,垂直握持加样器,使吸头浸入液面下2~3毫米处,然后缓慢平稳地松开按钮,吸入液体,等一秒钟,然后将吸头提离液面,贴壁停留2-3秒,使管尖外侧的液滴滑落。

    4放液:

1)将吸头口贴到容器内壁底部并保持10°~ 40°倾斜。(2)平稳地把按钮压到第一停点,等一秒钟后再把按钮压到第二停点以排出剩余液体。(3)压住按钮,同时提起加样器,使吸头贴容器壁擦过。(4)松开按钮。(5)按吸头弹射器除去吸头。

5加样器吸嘴为一次性使用

 

四、试管中液体的混匀法

1甩动法或旋转法右手掌心顶住试管上口,五指紧握试管,利用腕力使试管向一个方向做圆周运动,使管内液体旋涡而混匀。

2振荡器混匀法:将装有混合的液体的容器置于振荡器海绵上(工作台),开启振荡器,用手紧握容器,振荡30秒到1分钟即可。

3指弹法(液体量少):左手持试管上端,使试管垂直于地面,再用右手手指轻轻的弹动试管。试管的液体较少时可采用此方法。

4倒转法与玻棒搅拌法(不常用):用烧杯、量筒以及容量瓶配置溶液时,可用玻璃棒或倒转法。

5吸管混匀法:用清洁吸管将液体反复吸放数次,使溶液充分混匀。成倍的稀释某种液体时可以使用此法。

 

五、常用生化实验样品的制备

1全血:容器干燥,清洁,内盛抗凝剂,血液注入容器后轻轻摇动,使血液与抗凝剂充分混匀,部分要求产即做,不立即进行试验的全血应放4度保存,个别不耐低温的应室温保存。、

常用的抗凝剂有草酸盐、柠檬酸盐、氟化钠及肝素。根据不同内容选用不同的抗凝剂。                       

2血浆:抗凝全血离心后得到的上清液,防止溶血。

3血清:无抗凝全血室温保存后,血细胞自然凝固后得到的上清液。

4尿液:定性实验只需要收集一次尿液即可。而定量实验要收集24小时的尿液量,通常是早晨一定时间的尿排出,至收集第二天早上同一时间。容器中加入防腐剂(甲苯,盐酸等),为1000ml尿加入5ml防腐剂。

5组织匀浆:准确称取新鲜组织+缓冲液(等量),剪碎组织后,手工用玻璃匀浆器磨碎组织得到的组织液。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

实验二  硫酸铜溶液标准曲线的绘制

一、实验目的

1.掌握分光光度法的原理;

2.了解分光光度计的原理及操作;

3标准曲线的绘制。

 

二、实验原理

分光光度法原理定义:利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征,来确定其性质、结构或含量的技术,称为光谱分析技术。可见光波长:760-400nm;紫外线波长<400nm;红外线波长:>760 nm

当一束单色光通过透明介质时由于一部分光被溶液吸收而光线强度减弱。这种光波被溶液吸收的现象可用于某些物质的定量和定性分析。分光光度法的原理是依据Lamber-Beer定律。

1Lamber定律:当一束单色光通过透明介质时由于一部分光被溶液吸收而光线强度减弱,当溶液浓度不变时,透过的液层越厚,则光线减弱越明显。光吸收与厚度间的关系呈正比,即:A=K1L

 2Beer定律:当一束单色光通过透明介质时由于一部分光被溶液吸收而光线强度减弱,当溶液透过的液层不变的时候,溶液浓度不变越大,则光线减弱越明显。光吸收与浓度呈正比,即:A=K2C

3Lamber-Beer定律Lamber定律和Beer定律相结合,其吸光度与溶液浓度、厚度的关系是A=K3CL

4待测液体的计算 测定时直接读取吸光度值,按照下列方式处理,可计算出待测液体的浓度。

1)计算法

依据一定浓度范围内的硫酸铜溶液,在特定波长下的吸光度与其浓度成正比的关系,通过未知和已知浓度硫酸铜溶液的吸光度之比,可算出待测硫酸铜溶液的浓度;CU=AU/ASχCS

2)利用标准曲线求出待测溶液的浓度

标准曲线的绘制:在方格坐标纸上,以硫酸铜溶液的浓度为横坐标,以各浓度标准硫酸铜溶液相应的吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

    用待测浓度的硫酸铜溶液的吸光度值,在标准曲线上直接查得相应的浓度数值

 

三、操作步骤

按表1准备好试管,并加好各种溶液:

1  硫酸铜溶液标准曲线绘制的操作表格

试剂(mL

空白管(B

标准管(S

测定管(U

1

2

3

4

未知浓度硫酸铜溶液

  

   

    

   

4.0

10%硫酸铜溶液

 0.5

   1.0

   2.0

  3.0

蒸馏水

4.0

 3.5

   3.0

   2.0

  1.0

A

 

 

 

 

 

 

混合各试剂后,利用722型可见光分光光度计,选用630nm波长,以“空白管”调零,分别读取不同浓度的硫酸铜溶液的吸光度值,记录好原始数据。

 

四、结果计算

未知硫酸铜浓度的计算:

    1利用标准管法计算: CU=AU/ASχCS

    2)利用标准曲线测定

    标准曲线的绘制:在方格坐标纸上,以硫酸铜溶液的浓度为横坐标,以各浓度标准硫酸铜溶液相应的吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

用待测浓度的硫酸铜溶液的吸光度值,在标准曲线上直接查得相应的浓度数值。

 

五、注意事项

1.该实验着重于基本操作训练,必须正确使用吸量管,正确分配吸量管。

2.溶液的吸取必须正确。

3.正确绘制标准曲线。

4.测定管浓度可查标准曲线,亦可用计算公式计算,学生二种方法均应做。

实验三  双缩脲法测定血清总蛋白  

一、实验目的

1.掌握双缩脲法测定血清总蛋白的原理及操作。

2.了解血清总蛋白测定的临床意义。

 

二、实验原理

血清(浆)中蛋白质的肽键(-CO-NH-)在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲(H2N-OC-NH-CO-NH2)在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似,故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰,吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系,经与同样处理的蛋白质标准液比较,即可求得蛋白质含量。

 

三、试剂与器材

可购商品试剂或自配。

16 mol/L NaOH溶液  称取NaOH 240g,溶于新鲜制备的蒸馏水(或刚煮沸冷却的去离子水)约800ml中,冷却后定容至1 L,贮于有盖塑料瓶中。若用非新开瓶的NaOH,须先配成饱和溶液,静置2w左右,使碳酸盐沉淀,其上清饱和NaOH溶液经滴定后,算出准确浓度再使用。

2.双缩脲试剂  称取硫酸铜结晶(CuSO4·5H2O3g溶于新鲜制备的蒸馏水(或刚煮沸冷却的去离子水)500ml中,加入酒石酸钾钠(NaKC4H4O6·4H2O,用以结合Cu2+,防止CuO在碱性条件下沉淀)9gKI(防止碱性酒石酸铜自动还原并防止Cu2O的离析)5g,待完全溶解后,在搅拌下加入6mol/L NaOH溶液100ml,并用蒸馏水定容至1L,置塑料瓶中盖紧保存。此试剂室温下可稳定半年,若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。

3.双缩脲空白试剂  除不含硫酸铜外,其余成分与双缩脲试剂相同。

46070g/L蛋白质标准液  常用牛血清清蛋白或收集混合血清(无黄疸、无溶血、乙型肝炎表面抗原阴性、肝肾功能正常的人血清),经凯氏定氮法定值,亦可用定值参考血清或标准清蛋白作标准。但定值质控血清定值准确性较差,不能用作血清总蛋白测定的标准物。

5.仪器  自动生化分析仪或分光光度计。

 

四、操作步骤

1.自动生化分析仪法  按试剂盒说明书提供的参数进行操作。

2.手工操作法  

1)手工操作参数:波长540nm,光径1cm;温度:室温(1826);模式:终点法;反应时间:30min,样本量:100μl,试剂量:5ml

2)操作:取试管4支,标明测定管(U)、标准管(S)、标本空白管(B)、试剂空白管(RB),按表1操作。

1  双缩脲法测定血清总蛋白操作表格

加入物ml

B

RB

S

U

血清

0.10

0.10

蛋白标准液

0.10

蒸馏水

0.10

双缩脲空白试剂

5.0

双缩脲试剂

5.0

5.0

5.0

混匀,置25℃30min37℃10min,在波长540nm处比色,用蒸馏水调零,测各管吸光度。

 

五、结果计算

      1计算公式:

                              AU- ARB- AB

血清总蛋白(g/L=    ————   ×C

                           AS-ARB

2参考范围

正常成人血清总蛋白:6080g/L。长久卧床者约低35g/L60岁以上约低2g/L,新生儿总蛋白浓度较低,随后逐月缓慢上升,大约1年后达成人水平。参见表2

 

2   血清总蛋白与年龄和体位的关系

年龄

参考范围

体位

参考范围

早产儿

3660 g/L

非卧床

6483g/L

新生儿

4670g/L

卧床

6078g/L

1周龄

4476g/L

 

 

7月龄~1

5173g/L

 

 

12

5675 g/L

 

 

≥3成人

6080g/L

 

 

 

六、临床意义

     1.血清总蛋白浓度降低

1蛋白质合成障碍:当肝功能严重受损时,蛋白质合成减少,以清蛋白降低最为显著。

2)蛋白质丢失增加:严重烧伤,大量血浆渗出;大出血;肾病综合征尿中长期丢失蛋白质;溃疡性结肠炎可从粪便中长期丢失一定量的蛋白质。

3)营养不良或消耗增加:营养失调、低蛋白饮食、维生素缺乏症或慢性肠道疾病所引起的吸收不良使体内缺乏合成蛋白质的原料;长期患消耗性疾病,如严重结核病、恶性肿瘤和甲状腺功能亢进等,均可导致血清总蛋白浓度降低。

4)血浆稀释:如静脉注射过多低渗溶液或各种原因引起的水钠潴留。

     2.血清总蛋白浓度增高

    1)蛋白质合成增加:大多见于多发性骨髓瘤患者,此时主要是异常球蛋白增加,使血清总蛋白增加。

2)血浆浓缩:如急性脱水(如呕吐、腹泻、高烧等),外伤性休克(毛细血管通透性增大),慢性肾上腺皮质功能减退(尿排钠增多引起继发性失水)。

 

七、注意事项

    1.黄疸血清、严重溶血、葡萄糖、酚酞及溴磺酞钠对本法有明显干扰,故用标本空白管来消除。但如标本空白管吸光度太高,可影响测定的准确度。

    2.高脂血症混浊血清会干扰比色,可采用下述方法消除:取2支带塞试管或离心管,各加待测血清0.1ml,再加蒸馏水0.5ml和丙酮10ml,塞紧并颠倒混匀10次后离心,倾去上清液,将试管倒立于滤纸上吸去残余液体。向沉淀中分别加入双缩脲试剂及双缩脲空白试剂,再进行与上述相同的其他操作和计算。

    3.双缩脲试剂要封闭贮存,防止吸收空气中的二氧化碳。

4.本法也可用于血清总蛋白浓度的标化,测定的操作步骤完全与测定标本时相同,但显色温度须控制在(25±1的范围内,以及使用经过校正的高级分光光度计(波长带宽≤2nm,比色杯光径为准确1.0cm)进行比色。然后再按下式计算标化结果:

        

式中0.298为蛋白质双缩脲络合物的比吸光系数。即按Doumas双缩脲试剂的标准配方,在上述规定的测定条件下,双缩脲反应液中蛋白质浓度为1.0g/L时的吸光度。

 

八、方法学评价

1.双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比关系,与蛋白质的种类、分子量及氨基酸的组成无明显关系,各种蛋白质的显色程度基本相同。

2.本法重复性好,RCV4%CCV3.9%;线性范围为0140g/L;本法干扰少,并且大多可以避免;使用单一的稳定试剂,操作简便、快速,既适于手工操作,也便于自动化分析,已被推荐为测定血清总蛋白的参考方法。

3.唯一的缺点是灵敏度较低,比酚试剂法低约100倍。但本法的检出限为0.21.7g/L,这相当于70g/L的血清324μl,已能满足临床生化检验的需要。

4.本法是临床测定血清总蛋白质首选最方便、最实用的常规方法。

5.临床上常见的血清蛋白定量法主要有双缩脲法、临床折射计法、染料结合法、BCA法和免疫比浊法。

 

 

 

 

 

实验四  紫外分光光度法测定血清白蛋白

一、实验目的

1. 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。

2. 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。

3. 掌握紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。

 

二、实验原理

    本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。大多数蛋白质中酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸残基的苯环含有共轭双键,因此,蛋白质具有吸收紫外光的性质,其最大吸收峰位于280 nm附近(不同的蛋白质吸收波长略有差别)。在最大吸收波长处,吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。由于生物样品中常混有核酸,核酸中的碱基对紫外也有吸收,但其峰值在260nm附近,因此可用下列公式计算蛋白质浓度:

Lowry-Kalckar公式:蛋白质浓度(g/L=1.45A280-0.74A260)

A280A260分别代表光径为1cm时蛋白质溶液在280nm260nm处测得的吸光度值。)

 

 

三、实验操作

1实验操作步骤

1) 取待测血清0.1ml于大号试管内

2) 取生理盐水9.9ml加入到此试管内,边放边震荡,轻轻混匀

3) 生理盐水调零,测定波长280nm及波长260nm的吸光度值

2紫外分光光度计的使用方法

1接通电源,打开仪器开关,预热10min

2调波长为260nm

3)依次把生理盐水、待测液倒入比色杯内,放入比色槽

4)推动拉杆至最前方,以生理盐水调零

5测定待测液的值

6调波长为280nm,重复3~6步的操作

 

四、结果计算

蛋白质浓度(g/L=1.45A280-0.74A260) ×100

参考范围: 正常人:60~80g/L

 

五、注意事项

1. 实验每次测量前,要洗干净比色皿,要滤纸檫干。

2. 注意实验操作时,计算机的操作与应用。

3. 由于蛋白质的紫外吸收峰常因PH的改变而有改变,故进行样品测定时的PH最好与标准曲线制作时的PH一致。

4. 在测量前应把机器预热半小时。

5. 吸收曲线绘制前必须进行光谱的扫描。

6溶液一定要配制准确,以防影响实验效果,保证点在一条直线上。

7在作标准曲线进行定量前一定要选择最大的吸收波长,确保灵敏度高。

8在实际操作中,比色皿在使用中应注意保持干净,更不能触摸比色皿的光面,以防摩擦影响通光。

 

 

 

 

实验五  溴甲酚绿法测定血清白蛋白

一、实验目的

1.溴甲酚绿法测定血清白蛋白的原理。

2血清总蛋白测定的临床意义。

 

、实验原理 

血清白蛋白在pH4.2的缓冲液中带正电荷,在有非离子型表面活性剂存在时,可与带负电荷的染料溴甲酚绿(bromocresol greenBCG)结合形成蓝绿色复合物,在波长630nm处有吸收峰,其颜色深浅与白蛋白浓度成正比例,与同样处理的白蛋白标准比较,可求得血清中白蛋白含量。 

 

三、试剂与器材

11mol/L NaOH溶液  称取NaOH 4g加蒸馏水至100ml。

20.5mol/L琥珀酸缓冲贮存液(pH4.0)  称取NaOH 10g和琥珀酸56g,溶于蒸馏水800m1中,用lmmol/L NaOH 溶液调至pH4.1 ± 0.05后,加蒸馏水定容至1L。置4 ℃冰箱保存。 

310mmol/L BCG贮存液  称取BCG(MW720.02) 1.80g 溶于1mol/L NaOH溶液 5m1中,加蒸馏水至250ml 。 

4叠氮钠贮存液  称取叠氮钠4.0g 溶于蒸馏水中,配成100ml 。 

5聚氧化乙烯月桂醚 (Brij-35) 贮存液  称取Brij-35 25g溶于蒸馏水约80ml中,加温助溶,冷却后加蒸馏水至100m1。室温可稳定一年。 

6BCG试剂  在1L容量瓶内加蒸馏水约40ml,琥珀酸缓冲贮存液100ml,用吸管准确加入BCG贮存液8.0ml,并用蒸馏水冲洗吸管壁上残留的染料,加叠氮钠贮存液2.5ml、 Brij-35贮存液2.5ml,最后加蒸馏水至刻度,混匀。此溶液pH应为4.15 ± 0.05,盛于加塞的聚乙烯瓶内。在室温保存可稳定半年。 

740g/L白蛋白标准液  称取人血清白蛋白4g、叠氮钠35mg,溶于蒸馏水中并缓慢搅拌助溶,配成100ml。密封贮存于4℃冰箱,可稳定半年。也可用定值参考血清白蛋白标准。

8. 仪器  自动生化分析仪或分光光度计。 

四、操作步骤

1.生化自动分析仪分析法各参数见有关仪器操作说明书。 

2.手工操作法 

(1) 手工操作参数:波长630nm,光径1cm;温度:室温;模式:终点法;反应时间30s;样品量:0.02ml;试剂量:4ml.

(2) 操作:取试管5支,按表1 操作。 

1   BCG法测定血清白蛋白操作表格

加入物(ml          空白管           标准管×2         测定管×2

血清                  —                               0.02

白蛋白标准液           —               0.02               —

蒸馏水                0.02               —                —

BCG试剂              4.0               4.0                4.0

 

在波长630nm,处用空白管调零,用定量加液器加BCG试剂,与测定管血清混合后,立即在30s±3s内,读取吸光度。

如标本因严重高脂血症而混浊,需加做标本空白管(取血清0.02ml,加入琥珀酸缓冲贮存液4.0ml),用琥珀酸缓冲贮存液调零,测定标本空白管吸光度。用测定管吸光度减去标本空白管吸光度后,再计算结果。

 

、结果计算

血清白蛋白(g/L)=                   白蛋白标准液浓度(g/L)

同时用双缩脲法测定血清标本中总蛋白浓度,减去血清白蛋白浓度即为球蛋白浓度,即可求得血清白蛋白/球蛋白比值(A/G比值) 。 

参考范围:  正常成人35~55g/L

A/G比值:1.5-2.5/1

 

六、临床意义

1.血清白蛋白浓度增高常见于严重脱水所致的血浆浓缩。

2.血清白蛋白浓度降低在临床上比较重要和常见,通常与总蛋白降低的原因大致相同。急性降低主要见于大出血和严重烧伤;慢性降低见于肾病蛋白尿、肝功能受损、肠道肿瘤及结核病伴慢性出血、营养不良和恶性肿瘤等。血清白蛋白低于20g/L,临床上出现水肿。

    3.A/G比值某些病人可同时出现白蛋白减少和球蛋白升高的现象,严重者A/G比值 <1.0,这种情况称为A/G比值倒置。

4.文献报道还有极少见的因白蛋白合成障碍,血清中几乎没有白蛋白的先天性白蛋白缺乏症。

 

七、注意事项

1.BCG是一种pH指示剂,变色域为pH3.8(显黄色)~5.4(显蓝绿色),因此控制反应液的pH是本法测定的关键。 

    2.配制BCG试剂也可用其他缓冲液如枸橼酸盐或乳酸盐缓冲液。但以琥珀酸盐缓冲液的校正曲线通过原点,线性好,灵敏度高,成为首选推荐配方。 

    3.试剂中的Brij-35也可用其他表面活性剂代替,如吐温-20或吐温-80,终浓度为2m1/L,灵敏度和线性范围不变。

    4.当40g/L的白蛋白标准液与BCG结合后,溶液光径1.0ml,在630nm处测定的吸光度应为0.811±0.035,如达不到此值,表示灵敏度较差。 

    5.蛋白质标准是一个复杂问题。实验证明,BCG不但与白蛋白呈色,而且与血清中多种蛋白质成分呈色,其中以α1-球蛋白、运铁蛋白、结合珠蛋白更为显著,其反应速度较白蛋白稍慢。由于在30s内呈色对白蛋白特异,故BCG与血清混合后,在30s读取吸光度,可明显减少非特异性呈色反应。为了减少本法基质效应的影响,最好用参考血清作标准。 

 

八、方法学评价

1.本法操作简便、快速,胆红素、溶血和中度脂血无干扰,既可手工操作,也能自动化分析,是目前国内测定血清白蛋白的最常用方法。

2.本法线性范围为 10~60g/L。RCV<4%。但该法与溴甲酚紫法比较,对血清白蛋白特异性稍差。 

    3.血清白蛋白测定法主要有色氨酸含量法、染料结合法、电泳法、免疫化学法和电化学测定法。 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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